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A BIÓPSIA DE MÚSCULO DEVE SER CONGELADA. As fibras musculares esqueléticas contêm enzimas que permitem diferenciar as fibras em tipos fisiológicos, e dão informações de grande importância para o diagnóstico. Para aproveitar este potencial, o fragmento de músculo não pode ser fixado em formol, pois este inativa a atividade enzimática. É necessário congelar o músculo, de preferência alguns minutos após a retirada, enquanto as células estão vivas e a atividade enzimática e a ultraestrutura intactas. O CONGELAMENTO TEM QUE SER INSTANTÂNEO. Durante o congelamento é comum formarem-se cristais de gelo no tecido, dentro e fora das células. Os cristais comprimem as estruturas celulares e podem inutilizar totalmente o material para estudos morfológicos. Este problema é evitado se o congelamento for muito rápido (frações de segundo), pois assim não se formam cristais. Quando o procedimento é bem sucedido, a estrutura do músculo fica melhor que na inclusão em parafina. Há conservação das miofibrilas e do sarcoplasma intermiofibrilar, ou seja, do citoplasma e organelas (como as mitocôndrias e retículo sarcoplasmático) que garantem o funcionamento da fibra. |
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ARTEFATO DE GELO EM MÚSCULO ESQUELÉTICO. Os cristais de gelo formados no congelamento lento dão um aspecto em queijo suiço ao material. Este músculo foi posto em um freezer a -20ºC. |
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PASSO A PASSO |
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| A biópsia é um procedimento feito no centro cirúrgico ambulatorial sob anestesia local. Após abertura dos planos superficiais, incide-se a fascia do músculo (freqüentemente o bíceps braquial) e retira-se um cilindro de tecido muscular de cerca de 1 cm de comprimento por 0,5 cm de diâmetro. | O fragmento é envolto em uma gase com soro fisiológico e levado imediatamente ao laboratório, onde é recortado com bisturi sobre uma placa de cera dental. Os fragmentos a serem congelados são montados em bloquinhos de madeira usando-se o composto Tissue-Tek (na bisnaga). |
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| Um pequeno cilindro de músculo é colado ao toquinho de madeira, onde se inscreve o número da biópsia. Fragmentos menores, com cerca de 1 mm no maior diâmetro (ainda sobre a placa), serão colocados no fixador de Karnovsky para microscopia eletrônica. | Para o congelamento, usa-se n-hexano refrigerado em nitrogênio líquido. Uma pequena quantidade de hexano (cerca de 20 ml) é colocado na caneca de alumínio e esta imersa na caixa de isopor contendo nitrogênio líquido. Quando o hexano fica pastoso (começando a congelar) é o ponto ótimo. |
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| O fragmento é introduzido na caneca com hexano e são feitos movimentos circulares junto à periferia da caneca. O hexano da periferia está mais frio e o movimento ajuda a roubar calor do bloco o mais rapidamente possível. | |
| Por quê não
por o fragmento diretamente no nitrogênio líquido ?
Porque o fragmento, estando a temperatura ambiente, causa formação de uma bolha de nitrogênio gasoso a sua volta, que atua como isolante térmico e impede o congelamento instantâneo. Como o hexano é liquido mesmo à temperatura ambiente, este problema não ocorre. |
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| No bloquinho congelado o Tissue-Tek passa a cor branca. | Uma base metálica é preparada com Tissue-Tek para receber o fragmento de músculo congelado para fazer cortes no criostato. |
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O criostato é um micrótomo montado dentro de um freezer e trabalha com temperaturas em torno de -20ºC. Os cortes de músculo assim obtidos são montados em lamínulas (não lâminas) para as reações histoquímicas. Técnicas convencionais como HE e tricrômico de Gomori também são feitas nos cortes de criostato. A qualidade é muito superior à de material formolizado e incluído em parafina. |
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As reações histoquímicas são feitas em cubetas de vidro de 10 ml. para economizar os reagentes (caríssimos). São processados 7 casos por vêz. Em nosso serviço utilizamos a ATPase em pHs 4,6 e 9,4, enzimas oxidativas (NADH-TR e SDH) e ORO (oil-red-O, uma técnica para gorduras neutras). PAS para glicogênio é feito em casos selecionados. |
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| Para microscopia eletrônica, os fragmentos com 1 mm de lado recebem processamento especial, que inclui fixação em Karnovsky, seguido por tetróxido de ósmio. São incluídos em Araldite (não parafina) e cortados em um ultramicrótomo que permite obter cortes de até 0,1 mm de espessura (espessura de cortes de parafina comuns = 6 mm). Para técnica de microscopia eletrônica em maior detalhe, clique. |
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